本研究利用16S rRNA测序分析对塑料圈微生物群落的结构与功能进行了探究。
自然海洋环境中塑料圈微生物群落的结构和组装机制
The structure and assembly mechanisms of plastisphere microbial community in natural marine environment
作者：Sheng-Jie Zhanga , Yan-Hua Zeng a , Jian-Ming Zhu a , Zhong-Hua Cai a,b, Jin Zhou a,b*
期刊：Journal of Hazardous Materials
时间：2021.7.30
影响因子：10.588
一、文章摘要
最近，海洋环境中微塑料(MPs)上的微生物定植特征引起了全球的兴趣。然而，许多研究只是描述了塑料圈微生物群落特征，却没有考虑微生物群落组装背后的生态过程。在此，作者在1周、4周和8周进行了三时间点暴露实验，并研究了天然沿海水体中聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯5种MP颗粒的定植动力学。通过16S rRNA高通量测序，作者发现塑料圈微生物群落的多样性和均匀性高于海水微生物群落(p < 0.05)，并且微生物定植受环境因素、聚合物类型和暴露时间的共同影响。潜在功能和共现网络分析表明，MP暴露增强了外源生物降解潜力，降低了MP微生物网络的复杂性。同时，零模型分析表明，随机过程比确定性过程在塑料圈微生物群落结构的形成中发挥了更大的作用，扩散限制在更大程度上决定了微生物的演替轨迹。该研究加强了大家对塑料相关微生物在定植过程中控制微生物群落模式的生态机制的理解。
二、主要内容
1.MP暴露期间的环境参数
在实验中评估的物理参数中，从第1周到第8周，温度和浊度变化显著(p < 0.05)。相比之下，盐度和pH值无显著差异。在化学参数中，总有机碳(TOC)在0.808 ~ 2.258 mg/L范围内变化，第4周达到峰值，同时DO浓度达到最大值(6.84 mg/L)。此外，氮源物质(NO3、NO2和NH4+)浓度在0.0025 ~ 0.072 mg/L之间波动。
2. 不同MP基质上细菌多样性的时间分布
经过组装和质量过滤，75个样本共9441864条高质量序列聚类成208646个OTUs。利用α-多样性估计细菌群落复杂度，包括丰富度（Chao1指数）和多样性（Shannon指数）。在1-8周内，除贝壳外的所有基质的细菌丰富度和多样性均有增加(p<0.05)。在第1周，与浮游细菌群落相比，除PVC外，MPs上的细菌丰富度和多样性均无显著差异。但随着暴露时间的延长，在第8周，MP颗粒的丰富度显著高于海水细菌(p < 0.05)。同样，PP和ABS也有较高的多样性。在聚合物类型方面，第1周，PVC的多样性较低，而在第8周，PS的丰富度和多样性最低。综上所述，塑料圈群落多样性受暴露时间和聚合物类型的影响。
图1 海水样品和生物膜样品中细菌群落的Chao1指数（A）和Shannon指数（B）
3.塑料圈微生物群落与环境因子的聚类分析及相关性研究
采用基于Bray-Curtis差异矩阵的NMDS方法，识别海水与塑料圈微生物群落的分离模式。三个时间点之间的细菌群落结构存在明显的分离。海水、自然基质(木材和贝壳)和MPs之间的微生物类群在8周暴露期间具有不同的聚类分布，此外，五种类型的聚合物上的微生物聚类分布随时间变化而变化。在初始阶段（1周），塑料圈群落紧密聚集。中期（4周），MP相关菌群的置信椭圆显著偏离了水体和自然基质中的相关菌群的置信椭圆(p < 0.05)。进入最后阶段（8周），PE、PP、PS、ABS上的细菌群落置信椭圆几乎完全重叠，说明这些材料上的细菌群落具有相似性。为了阐明环境因素对MP相关细菌群落结构的影响，作者进行了RDA分析，发现MPs上的细菌群落多样性与盐度、水流、pH、浊度、PO43-、NO3-呈正相关，与温度呈负相关。此外，利用VPA分析评价环境参数对细菌分布的影响。在OTU数据中观察到的微生物群落变化中，发现营养物、物理和化学因素分别占14.3%、8.7%和4.6%。约有62.9%的微生物种类变化不能用这些条件参数解释，说明其他因素也影响了塑料圈群落。
图2 不同时间点不同样品间细菌群落多样性的比较
4.不同暴露时间和基质类型情况下塑料圈微生物群落的分类组成
利用16S rRNA基因分析不同聚合物类型经过不同暴露时间后细菌定植的动力学过程。浮游细菌群落主要为变形菌、蓝藻菌、拟杆菌、浮霉菌和厚壁菌。第1周，所有样品中，γ-变形菌和α-变形菌都是优势菌群，1周后，海水样品中γ-变形菌的相对丰度显著低于MP样品。第4周生物膜样品上拟杆菌(Bacteroidetes)的丰度显著增加，第8周生物膜样品上浮霉菌 (Planctomycetacia)的丰度显著增加(p <0.05),表明相比生活在海水中，这些细菌更容易附着在颗粒上。另外，不同的聚合物类型之间也观察到显著的差异，每种类型都有一个特定的代表物种。科水平上，在初始暴露(1周)后，弧菌科、蓝藻科、红杆菌科和生丝单胞菌科(尤其是在PVC中)是5种MPs中相对丰度方面最具代表性的类群。进入第4周，，塑料和木材上黄杆菌的数量均高于贝壳。Family_XII 和Marinifilaceae 在贝壳上的分布均高于塑料。经过8周的暴露，Pirellulaceae和Cryomorphaceae 在塑料上富集，而黄杆菌科和Family_XII 在木材和贝壳上的比例分别显著增加(2-3倍)。通过LEfSe分析识别不同MP样本之间的生物标志物，发现一些细菌群落的生物标记物保持不变，还有一些样品的生物标志物随暴露时间的延长而变化。这些结果表明，标记菌属在不同微塑料类型上的定植具有底物优先性。
图3 不同样品在纲(A)和科(B)水平上的相对丰度
5.塑料圈微生物群落的网络分析
为了解细菌群落中类群之间的潜在相互作用，作者通过计算成对的Spearman相关系数（ρ>0.8），对显著的类群进行了共现网络分析。发现海水微生物群落的相关OTUs数量最高，其次是MPs和贝壳生物膜，木材生物膜的相关OTUs数量最低。这说明MP细菌群落网络比海水浮游细菌更简单。根据Newman（2006）的观点，如果模块化指数>为0.4，则网络具有模块化结构，可以分为几个独立的组。在本研究中，海水、MPs相关生物膜、木材/贝壳模块化指数分别为0.981、0.459–0.992、0.647–2.847，表明形成的网络具有模块化轮廓。此外，高度连接的节点代表的是在保护微生物群落的生态网络中发挥着作用的关键物种。利用这一标准，每个网络中有10个OTUs被识别为关键种属。塑料圈细菌群落的关键属包括更广泛的门，如变形菌门、拟杆菌门等。此外，微生物网络关键物种也表现出一定的基质偏好。
图4 海水、微塑料生物膜、木材生物膜和贝壳生物膜等微生物群落的共现性网络分析
6.与MPs相关的微生物的潜在功能
为了研究底物类型对生物膜群落中微生物功能多样性的影响，作者利用KEGG数据库对16S rRNA序列进行了注释。在比较海水和MP样品时发现，MPs上与细胞运动、脂质代谢、细胞过程和信号传导、外来生物降解和代谢相关的功能丰度显著较高(p<0.05)。MPs和自然基质之间的功能图谱也有显著差异。利用PVC作为具有代表性的基质进行分析，发现与PVC相比，核苷酸代谢和转录的代谢通路在木材和贝壳上富集。当比较生物膜中微生物的预测功能时，可以观察到五种底物类型之间的微生物功能组成存在差异，尽管这些差异的幅度相对较低。以PE和PVC 为例，与复制和修复、遗传信息处理、聚糖生物合成和代谢相关的通路在PE上富集，而与细胞运动、细胞生长和凋亡相关的通路在PVC 上富集。这些结果表明，MPs上微生物的代谢功能不同于周围的水体和自然基质。
图5 海水和微塑料样品中细菌群落(KEGG2级)的功能图谱
7.不同基质上塑料圈微生物群落的组合
通过计算β-NTI值来评估两种类型的细菌群落组装（确定性和随机性）在不同基质上的相对重要性。由于所有样品的β-NTI值均在0.036~0.037之间，说明随机性是影响所有测试样品细菌群落组装的主要因素。Venn图显示，超过一半的MP OTUs在海水中被观察到，表明大量的MP附着的原核生物可能来自于周围的水域。这些相似之处可能是由于MPs为某些倾向于在表面定居的原核生物成员提供了合适的生态位。不同聚合物类型的β-NTI值的差异可能反映了中性或非中性分布分区的迁移速率和分类组成。结合使用加权β-NTI和基于Bray-curtis的Raup-Crick(RCbray)来评估不同组装过程的相对贡献，并使用零模型分析来估计影响塑料圈群落组成的生态过程。对于MPs和自然基质上的细菌群落，扩散限制是最重要的生态过程，并解释了72.22–94.44%的群落更替。然而，在自由生活的微生物群落的数据集中，扩散限制、均匀化扩散和生态漂移分别占33.33%、28.79%和37.88%，表明各生态过程在推动海水样本中细菌群落聚集方面发挥相同重要性的作用。
图6 β-NTI在不同样本中的分布(A)及微生物组装过程中分散限制、均质化扩散和不确定性过程的比例(B)
三、结论与亮点
本研究采用16S rRNA基因扩增子测序，研究了MPs上不同类型聚合物对细菌组装图谱的影响。有助于了解在塑料圈微生态系统中影响微生物结构组装的特定生态过程。为了更全面地了解塑料微生物的组装机制和环境因素，分析其他参数，如水文特征、生态位类型、基质特征和更长的研究时间，改变随机性和确定性装配过程之间的动态平衡是必要的。
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